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研究猪胚胎多能样干细胞分离培养的方法

作者:平博app下载平博app罐 来源:原创 日期:2016-11-21 8:13:38 人气:49 加入收藏 标签:细胞冻存 平博app

猪胚胎干细胞分离培养自我更新和分化潜能,利用不同培养条件,从孤雌胚胎、细胞核移植胚胎和体内受精胚胎中分离样细胞。

1.细胞培养用于核移植供体的猪胎儿成纤维细胞

从初生猪仔的耳部分离得到。细胞培养基为DMEM15%胎牛血清,培养温度为37℃,5%CO2。细胞冻存,平博体育app0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化,中和后离心200Xg5min。将细胞重悬后并加入等量冻存液(40%DMEM40%FBS20%DMSO),贮存在平博app中。

2.卵母细胞的收集和准备

从屠宰场收集猪卵巢,保存在含有青/链霉素的生理盐水中,运输温度32~38℃,3h内运回实验室。采用抽吸法采集卵巢卵母细胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母细胞置于15mL离心管中,37℃水浴静置数分钟,待卵母细胞沉降后,用洗卵液洗2遍,显微镜下挑取颗粒细胞层达3层以上的卵丘卵母细胞复合物(cumulusoocytecomplexCOCs),然后将COCs转入U型皿中培养42~44h,每孔加500µL成熟培养液,每孔放置50~70枚。

3.孤雌激活和胚胎培养

用电融合仪将成熟的卵母细胞进行电激活,漂洗后,将卵母细胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分别将卵母细胞转移到胚胎培养基G1NCSU23和猪受精卵培养基,24h后记录卵裂率。3d后,将培养基G1中发育的胚胎移入囊胚培养基G2。再次培养3~4d后,统计囊胚个数并收集。

4.体细胞核移植胚胎培养

去除成熟卵母细胞第一极体,随后注入供体细胞。显微操作后,移入含10%FBSM199培养基,在38.5℃,5%CO2条件下孵育0.5h,平博体育app电融合仪进行激活处理,移入6D孵育2.5h后,将重组胚胎在NCSU23培养基中培养3d,随后替换NC-SU23继续培养3~5d,观察胚胎的发育。

5.体内胚胎的收集

从人工受精的母猪体内收集第7~8d的囊胚,所有方法参照Stokes2005)。每天监测母猪的发情,将发情日期作为0d,鉴定发情后的61218h进行人工受精。从子宫冲洗胚胎时平博体育app预热的含10%FBS的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersa-linePBS)

6.从猪胚胎分离胚胎多能干细胞

将去除透明带的囊胚接种到丝裂霉素C(mi-tomycin-C)处理过的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonicfibroblastcellsMEFs)饲养层上2~4d,囊胚内细胞团(innercellmassICM)3~5d后出现。待ICM大小适中时,用机械法分离细胞,重铺到新的饲养层上,并平博体育app不同的猪胚胎干细胞(por-cineembryonicstemcellspESCs)培养基(ESM1~ESM6表1),胚胎多能干细胞克隆每5~7d平博体育app机械法传代。

7.免疫荧光检测

平博体育app4%多聚甲醛固定胚胎10minPBS2次后,加入0.25%Triton-X室温30minPBS3次,1%BSA室温封闭1h4℃孵育一抗24h(1200CDX2;1200NANOG)PBS冲洗3次,孵育荧光标记的二抗(11000)室温1hPBS冲洗2次后,DAPI染色2minPBS冲洗2次后在荧光显微镜下观察照相。

8.qRT-PCR

平博体育app0.5%链霉蛋白酶A去除猪胚胎的透明带后,立刻加入5μL的裂解缓冲液(5mmol/L二硫苏糖醇1%NP-401U/uLRNA酶抑制剂),冰上孵育30min。平博体育app反转录试剂盒将裂解液反转录为cDNAqRT-PCR体系:cDNA2μLSYBRgreenmix12.5μL,上下游引物各0.3µmol/L0.5μLddH2O补充到25μL。反应程序:9530s955s6030s,共40个循环。

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